甘蓝型油菜苗期赤霉素含量及其代谢关键基因转录特性

为了解GA在甘蓝型油菜苗期杂种优势中的作用及温度对GA合成的影响，本研究选用杂种F1产量优势较强的杂交组合YG2009×YC4及其亲本为试验材料，分别在5、15、25℃生长，分析杂种F1及亲本苗龄20 d时农艺性状与GA总量的关系及GA总量随温度变化的趋势，并利用qPCR技术分析GA合成途径关键酶基因的相对转录水平。结果表明温度显著影响甘蓝型油菜幼苗中GA含量，进而影响幼苗的生长，随着温度的升高，不同材料株高、叶片数、叶宽、叶长、鲜重、干重等表型性状呈显著上升趋势；典型相关分析发现，表型性状与GA总量呈正相关，即GA总量升高，有利于甘蓝型油菜幼苗的生长。YG2009×YC4植株中GA总量随温度的升高呈上升趋势，25℃时达到最高，YG2009×YC4植株中GA总量比母本YG2009提高83.01%，比父本YC4提高100.72%，达到差异显著水平。25℃时，转录水平分析发现甘蓝型油菜不同部位GA代谢关键酶基因存在差异转录，导致各部位GA总量存在较大差异。灰色关联分析发现，GA2ox6相对转录水平与根中GA总量灰色关联度最高，GID1相对转录水平与茎中GA总量灰色关联度最高，GA20ox4相对转录水平与叶中GA总量灰色关联度最高，推测GA2ox6、GID1、GA20ox4相对转录水平对植株中GA总量影响较大。

目前，中国食用油自给率不足40%，严重依赖进口，是对外依存度最大的主要农产品。油菜是中国第一大国产植物油来源，占国产油料作物产油量的55%以上，菜籽油饱和脂肪酸含量低（≈7%），不饱和脂肪酸高达90%以上，是最健康的植物油之一[1]。因此，发展油菜生产对保障我国高品质食用油供给安全至关重要。赤霉素（gibberellins，GA）是植物体内合成的一类微量、具有生理活性的双萜类化学物质，在植物整个生命周期中都起着重要作用，参与种子萌发、叶片伸展、茎秆伸长、根的生长、花器官发育等[2,3]。GA主要存在于植株生长旺盛的部位，如茎端、嫩叶、根尖、种子等部位，且GA的种类、数量和状态因植物发育时期不同而异。GAs生物合成过程较为复杂，可分为3个阶段，首先是内根-贝壳杉烯（ent-kaurene）的生物合成，再由内根-贝壳杉烯到GA12醛，最后由GA12醛转变为其它各种GAs[4,5]。在高等植物中GA1、GA3、GA4和GA7是最常见的有生物活性的GAs[6]。不同物种、器官和发育阶段主要活性GA不同并且对生物生长发育的影响不同[7,8]。对转基因番茄和梨内源GAs水平的分析发现，PbGA20ox2在果实发育早期通过增加GA4的积累促进发育和坐果[8]。水稻长穗颈基因主要是通过调节内源GA1含量促进其最上节间剧烈伸长[9]。GA3是GA生物合成中至关重要的环节，GA3对植物休眠的解除具有重要的促进作用[10]。参与GA合成的关键酶主要包括KO（ent-kaurence oxidase）、KAO（ent-kaurenoic acid oxidase）、GA20ox1（GA20-oxidase 1）、GA20ox4（GA20-oxidase 4）、GA2ox6（GA2-oxidase 6）、GID1（gibberellin insensitive dwarf 1）、GID2（gibberellin insensitive dwarf 2）、D1（dwarf 1）等[11]。

杂种优势是生物界中普遍存在的一种生物学现象，其利用极大地促进了农业生产力的发展。GA与杂种优势研究前人已做了大量工作，如水稻（Oryza sativa L.）幼苗发育的杂种优势中GAs发挥重要的调节作用[4]；香脂杨（Populus balsamifera L.）杂交种中GA含量高，生长优势较强[12]；陆地棉（Gossypium hirsutum Linn.）杂交种的种子GA含量超过亲本[13]；与亲本自交系相比，杂交玉米（Zea mays L.）对外源GA更敏感，且GA在杂种株高生长优势中起重要作用[14]。研究还发现温度等环境因素会影响亲本及其后代的生长繁殖和产量[15]。GA代谢途径对温度的响应已有研究，如种子不同干燥温度影响GA代谢进而影响水稻种子活力[16]；低温或高温下GA处理可提高兰香草种子萌发率[17]；温度影响GA代谢关键酶基因的表达，调节植物节间GA含量和DELLA水平，改变植株表型[18]；栀子生长过程随温度降低，GA含量下降，有低温半致死现象[19]。综上，活性GA在植物营养生长阶段的杂种优势形成中起重要调节作用且活性GA总量受温度影响。油菜杂种优势利用研究始于20世纪60年代中期，目前中国杂交油菜种植面积已达油菜总面积的60%[1]。油菜的整个生育周期可分为营养生长、营养生长生殖生长并进和生殖生长三个阶段，其中，营养生长阶段即苗期是油菜植株形态建成和产量形成的重要基础时期。为进一步了解温度对GA合成的影响及GA在甘蓝型油菜苗期杂种优势形成过程中的作用，本研究选用产量杂种优势较强的杂交组合YG2009×YC4及其亲本为试验材料，通过不同温度处理，对苗期表型性状指标和GA总量测定，了解其生长特性，并借助qRT-PCR（quantitative Real-Time PCR）技术对GA合成途径中的关键酶基因相对转录水平进行分析，初步解析GA水平对甘蓝型油菜苗期生长发育的影响及苗期GA代谢途径关键酶转录特性，明确甘蓝型油菜秋发机理，以期为油菜高效栽培及新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蓝型油菜杂种F1产量优势较强的杂交组合YG2009×YC4及其亲本阳光2009（YG2009，中国油菜）、Czech Republic（YC4，欧洲油菜），由长江大学油料作物团队提供，试验于2021-2022年在长江大学生命科学学院实验室进行。

挑选饱满且大小一致的油菜种子，双层滤纸法萌发至两片真叶时移栽到种植盘中，分别置于5、15、25℃的培养室中培养，光周期为16 h光照/8 h黑暗，光强52 μmol·m-2·s-1，相对湿度为80%。每个处理设置3个重复。

1.2 指标测定及方法

1.2.1 内源赤霉素含量的测定

在甘蓝型油菜苗龄20 d时分别取不同温度处理下的甘蓝型油菜整株幼苗，苗龄60 d时分别取25℃温度处理下的甘蓝型油菜根、茎、叶组织（根组织取主根幼嫩部分，茎组织取茎秆中部节间，叶组织取顶部完全展开的幼嫩新叶），取样后立即于液氮中速冻，-80℃保存，用于激素提取。每个材料3次生物学重复，3次技术重复。

内源赤霉素采用甲醇浸提法提取[20]，高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定含量，流动相为甲醇和1%的乙酸溶液（甲醇∶乙酸溶液=45∶55），柱温为35℃，流速为 1 mL·min-1，检波为254 nm，进样量10 µL。

1.2.2 农艺性状相关指标

甘蓝型油菜苗龄20 d时随机选取各个材料10株，参照韦丁一[21]、李新华[22]的方法分别考察不同温度处理下的株高、叶片数、叶宽、叶长、鲜重、干重等农艺性状相关指标，记录油菜幼苗表型特征。

1.2.3 赤霉素代谢相关基因表达水平分析

因苗龄20 d时，25℃培养条件下YG2009×YC4 杂种F1幼苗GA总量与亲本差异较大，故进一步培养至苗龄60 d表型差异明显后，分别取根、茎、叶组织，取样部位与1.2.1内源赤霉素含量测定相同。用Trizol（Invitrogen，USA）法提取RNA，并用Hiscript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Vazyme）完成反转录。根据GA代谢通路，筛选出GA应答基因，Blast比对油菜泛基因组和比较基因组生物信息平台（BnPIR，http://cbi.hzau.edu.cn/bnapus）中对应的基因，利用Primer软件设计GA代谢途径相关基因荧光定量PCR引物，所用引物见表1。以甘蓝型油菜Actin（基因编号：NM_001316010.1）为内参基因，在CFX96TM荧光定量PCR仪（Bio-Rad，USA）完成qRT-PCR，用2-△△CT法计算目的基因相对转录水平。

1.3 数据统计分析

采用Microsoft Excel进行原始数据录入、计算和整理，利用DPS 7.05数据处理系统进行统计分析，Graphpad prism 9软件作图。处理间比较采用最小显著差异法（least significant difference，LSD）。

参照SILVA等[23]方法，以株高、叶片数、叶长、叶宽、鲜重、干重6个表型性状指标为X集合，幼苗GA总量为Y进行典型相关分析。

参照胡亚丽等[24]方法，对甘蓝型油菜各组织GA总量和GA合成途径关键酶基因转录水平关联程度做灰色关联度分析。GA总量为参考数列X0，8个基因的转录水平设为比较数列Xi，参数X0 和Xi 的关联系数和各因素的关联程度分别为：